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A:“数字PCR可以两色荧光做三重或者四重检测!”

B:“这怎么可能?”

A:“这很简单,让我仔细道来……”

 

如何实现多重定量检测?

多重检测即在一个反应中同时检测出多种不同的基因,可以带来更全面和准确的检测结果。分子检测发展至今,一方面对灵敏度和准确性带来更高的要求,另一方面也对多重检测也带来更多的需要。多重分子检测目前使用广泛的方法是荧光定量PCR,使用多色荧光的方式进行多重检测,但受制于硬件及试剂限制,荧光定量PCR多重检测一般限制在5色以内。数字PCR的出现,在满足更好灵敏度和直接定量的高要求同时,也能够突破荧光通道的限制,带来更多重的检测。

 

案例分享:新冠病毒委外标准品检测实验

实验设计

在新型冠状病毒检测中,根据国家CDC发布的指导原则,需要同时检测新冠病毒ORF1ab基因和N基因。与此同时,还增加了人RNase P基因的检测用于对样品进行质控,因此最终需要三重检测。传统思路下,需要使用三色荧光探针分别对应三个荧光通道进行检测,但在数字PCR检测中,仅使用两个荧光通道即可。

在数字PCR双荧光三重检测中,在配置试剂时,ORF1ab使用高浓度的FAM特异探针,ORF1ab基因使用高浓度的CY5特异探针,而RNase P基因同时使用低浓度同序列但不同修饰的FAM探针和CY5探针。在形成分区后,每个分区都含有相同类型和浓度的探针,而每个分区中,理想情况下只有ORF1ab/N/Rnase P三种基因的单个基因。PCR反应后,含有N基因的分区,会发出高强度的FAM信号;含有ORF1ab基因的分区,会发出高强度的CY5信号;含有RNase P基因的分区会同时发出低强度的FAM和CY5信号。因此,可以通过每个分区中的荧光信号类型及其强度,判断为哪种基因的阳性液滴,最后通过各基因阳性液滴的数量,结合泊松分布公式,即可测算各基因的浓度。

随着基因浓度的增加,每个分区也会有多种基因的情况,此分区的荧光信号就是各种基因对应荧光的累加。例如,OFR1ab和N基因同时在一个液滴中,则此液滴的荧光信号即为高强度的FAM和高强度的CY5信号;OFR1ab基因和CY5基因在同一个液滴中,此液滴的荧光信号即为超高强度的CY5信号和低强度的FAM信号,以此类推(见下图)。因此可以轻松判断出每一个液滴里面所含有的基因类型。

 

实验步骤

1、RT反应体系预混:把Mix试剂、RT逆转录所需的酶、引物探针预混。

2、假病毒稀释样品:4个浓度梯度的假病毒样品。

3、液滴生成:每孔加入20微升反应体系(预混液13微升+待测样品液7微升)和70微升油,生成多组平行样品液滴。

4、PCR扩增循环:进行RT-ddPCR一步法扩增反应。

5、使用达普星云数字PCR进行液滴扫描成像,并分析结果。

 

结果展示

该实验是某检测机构首次应用达普星云数字PCR来对新冠病毒标准品的定量检测,模拟在低浓度范围内对新冠病毒的检测能力。结果显示,在低拷贝数的四个浓度梯度下,检测结果符合预期,R2线性结果好。值得一提的是,数字PCR具有超高的检测灵敏度和优秀的重复性,反应检测限可低至0.2cp/μl,用户表示满意。

 

讨论:如何实现更多重检测?

当需要检测更多重的基因时,只需要对每种基因对应的探针类型和浓度进行配置即可。如双色荧光四重检测:A基因为FAM高浓度探针,B基因为FAM低浓度和CY5中浓度探针,C基因为FAM中浓度和CY5低浓度探针,D基因为CY5高浓度探针(见下图)。而随着荧光通道的增加,搭配的可能性会有无限提升。

当然,随着检测基因的增加,散点团也会成倍的增加,在双通道四重分析中(见上图),2D图已经有16个散点团。只有散点团相互分离,才能对每一个液滴进行准确分析,这对数字PCR系统带来的更高的要求:更稳定的液滴,更高效的试剂,更优秀的光路。

 


达普生物科技,拥有多项液滴微流控专利技术,团队布局芯片、试剂、光路、软件等数字PCR全产业链,完全掌握数字PCR的每一个细节。现已上市的星云数字PCR系统Lite版,可以完美实现双色荧通道四重检测分析,并实现精准定量,达到国际领先水平。达普生物将会在近期推出新一代数字PCR系统Pro版,届时三个荧光通道,带来更多无限可能。

 

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